酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）作為一種廣泛應(yīng)用的免疫檢測技術(shù)，在臨床診斷、疾病研究、食品安全檢測以及環(huán)境監(jiān)測等多個領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其核心是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，并通過酶促化學反應(yīng)將這種結(jié)合轉(zhuǎn)化為可定量或定性測量的信號。根據(jù)實際檢測需求的不同，
ELISA試劑盒的設(shè)計呈現(xiàn)多樣化的特點，包括但不限于雙抗體夾心法、間接法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體以及應(yīng)用親和素-生物素系統(tǒng)的ELISA等。
1.雙抗體夾心法（Sandwich ELISA）
在雙抗體夾心法中，首先將針對目標抗原的捕獲抗體固定于固相載體上形成固相抗體層，然后加入待測樣本使得抗原與固相抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的成分后，再加入能與抗原另一表位結(jié)合的酶標抗體。經(jīng)過進一步的溫育和洗滌步驟，最后通過酶催化底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，顏色深淺與樣本中的抗原含量成正比，從而實現(xiàn)定量分析。
2.間接法ELISA
間接法ELISA中，固相載體上的抗體同樣用于捕獲抗原，但后續(xù)步驟有所不同。此處不是加入酶標抗體，而是先加入待測樣本并允許抗原與抗體結(jié)合后，再添加酶標記的抗體（通常為抗物種抗體），它與樣本中的抗體結(jié)合而非直接與抗原結(jié)合。這種方法的優(yōu)勢在于它可以檢測多種類型的抗體，但由于增加了步驟，可能面臨交叉反應(yīng)和背景較高的風險。
3.競爭法ELISA
競爭法ELISA中，待測樣本和酶標記的抗原同時與有限的抗體結(jié)合。樣本中的抗原和酶標抗原競爭結(jié)合同一個抗體位點，因此，樣本中抗原濃度越高，結(jié)合到固相抗體的酶標記抗原就越少，最終產(chǎn)生的顏色強度越弱。此法適用于測定小分子抗原或多肽類物質(zhì)。
4.雙位點一步法ELISA
在這種設(shè)計中，抗原和酶標抗體預(yù)先偶聯(lián)形成復(fù)合物，然后一起加入到固相抗體預(yù)包被的板孔中。如果待測樣本中含有相同抗原，則會競爭結(jié)合固相抗體，導致酶標抗原-抗原復(fù)合物的結(jié)合減少。隨后的酶催化反應(yīng)及顯色步驟可用于定量分析。
5.IgM抗體捕獲法
專門用于檢測IgM類抗體的捕獲法，通過固相包被抗人IgM抗體，使樣本中的IgM首先結(jié)合到固相上，之后加入抗原以捕獲與IgM特異性結(jié)合的部分，再通過酶標抗體檢測。此法特別適合于急性感染早期的IgM抗體檢測。
6.親和素-生物素系統(tǒng)（ABC-ELISA）
利用親和素對生物素很高的親和力，可以將生物素標記到抗體或抗原上，而酶則標記在親和素上。這樣既簡化了標記步驟，又提高了靈敏度和特異性。
制作工藝
-抗原或抗體的純化與標記：選擇合適的抗原或抗體，通過物理、化學或生物方法進行純化，并將其與酶（如辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AP）或其他標記物（如生物素）共價連接。
-固相包被：將標記好的抗體或抗原均勻地固定在塑料微孔板或其他固相載體表面，形成穩(wěn)定的固相層。
-試劑配制與質(zhì)量控制：制備標準曲線所需的已知濃度的標準品、洗滌液、酶標抗體溶液、底物溶液以及終止液等，并對每批試劑盒進行嚴格的質(zhì)量控制和性能驗證。
-封裝與保存：將各組分分裝至專用試劑瓶或管中，按照適宜條件密封保存，確保試劑盒的穩(wěn)定性和有效性。
ELISA試劑盒的設(shè)計與制作工藝復(fù)雜且精密，每一種方法都需要精心設(shè)計以滿足特定的檢測需求，從抗原抗體的選擇與標記，到固相載體的處理，再到整套試劑盒的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，每一個環(huán)節(jié)都對檢測結(jié)果的準確性和可靠性產(chǎn)生直接影響。
